Mi a Lysis puffer receptje?

Lizispuffer egy olyan oldat, amelyet a baktériumsejtek feltörésére vagy „lizálására” használnak, felszabadítva az intracelluláris tartalmat. Széles körben használják molekuláris biológiai és mikrobiológiai eljárásokban, például DNS- és fehérjekivonásban. A lízispuffer pontos összetétele az adott alkalmazástól és a lizálandó baktérium típusától függően változhat, de egy tipikus recept a következő összetevőket tartalmazza:

Tris-HCl (trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid): Ez pufferanyagként működik a puffer pH-értékének fenntartása érdekében. A lízispuffer pH-ja kulcsfontosságú, mivel befolyásolhatja a lépésekben részt vevő enzimek stabilitását és aktivitását.

EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav): Az EDTA egy kelátképző szer, amely kétértékű kationokhoz kötődik, mint például a magnézium (Mg2+) és a kalcium (Ca2+), amelyek elengedhetetlenek a baktériumsejtfal integritásának fenntartásához. Ezen ionok kelátképzésével az EDTA gyengíti a sejtfalat és elősegíti a sejtlízist.

NaCl (nátrium-klorid): NaCl-t tartalmaz a puffer, hogy fenntartsa az ozmotikus egyensúlyt és megőrizze a baktériumsejtek szerkezeti integritását. A megfelelő NaCl-koncentráció a lizálandó specifikus baktériumok sótoleranciájától függ.

Mosószer (pl. SDS vagy Triton X-100): A detergensek a lízispuffer kulcsfontosságú összetevői, mivel megbontják a bakteriális sejtmembrán lipid kettős rétegét. Az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy gyakran használt mosószer, de olyan alternatívák is használhatók, mint a Triton X-100 vagy az NP-40.

Lizozim: A lizozim egy olyan enzim, amely specifikusan hasítja a bakteriális sejtfal peptidoglikán rétegében található béta-1,4-glikozid kötéseket. A lizozim-kiegészítés a lízispufferben a peptidoglikán hálózat lebontásával fokozza a sejtek szétesését.

RNáz (ribonukleáz): Ha az RNS extrakció a cél, RNáz hozzáadható a lízispufferhez, hogy megakadályozzuk az RNS lebomlását a lízis eljárás során. Az RNáz enzimek lebontják az RNS molekulákat a foszfodiészter kötések felhasításával.

Proteáz (proteináz K): Ha a fehérje extrakció a cél, egy proteáz, például a Proteináz K beépíthető a lízispufferbe. A proteináz K egy robusztus enzim, amely a fehérjék széles skáláját képes megemészteni anélkül, hogy befolyásolná a kérdéses célfehérjék szerkezetét vagy aktivitását.

Az előkészítés során fel kell oldani a megfelelő mennyiségű Tris-HCl-t, EDTA-t, NaCl-t és a kiválasztott mosószert ultratiszta vagy steril desztillált vízben. Ezután a pH-t tömény sósavval (HCl) vagy nátrium-hidroxiddal (NaOH) állítjuk be a kívánt értékre, jellemzően 8,0 körüli pH-ra. Lizozimot, RNázt és Proteináz K-t adunk a javasolt koncentrációkban, és az oldatot alaposan összekeverjük, hogy biztosítsuk az összes komponens teljes feloldódását.

A végső lízispuffert megfelelő körülmények között, általában -20°C-on vagy -80°C-on kell tárolni, hogy megőrizze stabilitását és megakadályozza az enzimek lebomlását. Használat előtt a puffert fel kell olvasztani és alaposan össze kell keverni a homogenitás biztosítása érdekében.

Fontos a lizáló puffer összetételének optimalizálása a lizálandó konkrét baktériumok és a későbbi alkalmazások alapján. A hatékony sejtlízis elérése és a célmolekulák integritásának megőrzése érdekében szükség lehet a pH-érték, a mosószer-koncentráció vagy az enzimtípusok módosítására.