Hogyan használható az elisa a bt kukorica azonosítására?

Az ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) technika használható a Bt kukorica (a Bacillus thuringiensis inszekticid fehérjét expresszáló, genetikailag módosított kukorica) azonosítására a Bt-fehérje kukoricamintákban való jelenlétének kimutatásával. Így működik:

1. Mintaelőkészítés:A kukoricamintákat összegyűjtjük és finom porrá őröljük. A mintát ezután pufferoldattal extraháljuk, hogy felszabaduljanak a fehérjék, beleértve a Bt fehérjét is.

2. A mikrolemez üregeinek bevonása:A mikrolemez üregeit a Bt fehérjére specifikus befogó antitesttel vonjuk be. Ez az antitest a lyukak felületén van rögzítve.

3. Inkubálás mintakivonattal:A kukoricaminta-kivonatot hozzáadjuk a mikrolemez üregeihez, és meghatározott ideig inkubáljuk, lehetővé téve, hogy a Bt fehérje kötődjön a befogó antitesthez.

4. Mosási lépések:Inkubálás után a lyukakat pufferoldattal mossuk, hogy eltávolítsuk a meg nem kötött anyagokat.

5. Kimutatási ellenanyag hozzáadása:Egy enzimhez (általában torma-peroxidázhoz) konjugált detektáló antitestet adunk a lyukakba. Ez a kimutatható antitest a Bt-fehérje más epitópjára specifikus, mint a befogó antitest.

6. Második inkubáció:A mikrolemezt újra inkubáljuk, lehetővé téve, hogy a detektáló antitest kötődjön a befogó antitest által megfogott Bt fehérjéhez.

7. Szubsztrát hozzáadása:A kimutatási antitesthez konjugált enzimre specifikus szubsztrát oldatot adunk a lyukakba. Az enzim jelenlétében a szubsztrát olyan reakción megy keresztül, amely színes vagy fluoreszkáló terméket eredményez.

8. Kolorimetriás vagy fluorometrikus kimutatás:Minden egyes lyuk abszorbanciáját (kolorimetriás kimutatáshoz) vagy fluoreszcenciáját (fluorometrikus kimutatáshoz) mikrolemez-leolvasóval mérjük.

9. Adatelemzés:A kapott abszorbancia vagy fluoreszcencia értékeket összehasonlítjuk a Bt fehérje ismert koncentrációinak felhasználásával előállított standard görbével. Ez lehetővé teszi a kukoricamintában jelenlévő Bt fehérje mennyiségi meghatározását.

A Bt fehérje jelenlétének és mennyiségének kimutatásával az ELISA segítségével azonosítható és megkülönböztethető a Bt kukorica a nem Bt kukorica mintáktól. A pozitív eredmények a Bt fehérje jelenlétét jelzik, míg a negatív eredmények a Bt fehérje hiányát vagy a vizsgálat kimutatási határa alatti szinteket jelzik.