Hver er uppskriftin að Lysis buffer?

Lysis biðminni er lausn sem notuð er til að brjóta upp eða „lýsa“ bakteríufrumur og losa innanfrumuinnihaldið. Það er mikið notað í sameindalíffræði og örverufræðiaðferðum, svo sem DNA og próteinútdrátt. Nákvæm samsetning leysistuðpúða getur verið mismunandi eftir tiltekinni notkun og tegund baktería sem verið er að lýsa, en dæmigerð uppskrift inniheldur eftirfarandi þætti:

Tris-HCl (Tris(hýdroxýmetýl)amínómetanhýdróklóríð): Þetta virkar sem stuðpúði til að viðhalda pH-gildi stuðpúðans. Sýrustig lýsisbuffsins er mikilvægt þar sem það getur haft áhrif á stöðugleika og virkni ensíma sem taka þátt í skrefum.

EDTA (etýlendiamíntetraediksýra): EDTA er klóbindandi efni sem binst tvígildum katjónum eins og magnesíum (Mg2+) og kalsíum (Ca2+), sem eru nauðsynleg til að viðhalda heilleika bakteríufrumuveggsins. Með því að klóbinda þessar jónir veikir EDTA frumuvegginn og auðveldar frumusundrun.

NaCl (natríumklóríð): NaCl er innifalið í stuðpúðanum til að viðhalda osmósujafnvægi og varðveita byggingarheilleika bakteríufrumnanna. Viðeigandi NaCl styrkur fer eftir saltþoli tiltekinna baktería sem verið er að leysa.

Þvottaefni (t.d. SDS eða Triton X-100): Þvottaefni eru mikilvægir þættir í leysistuðpúðanum þar sem þau trufla lípíð tvílag frumuhimnu bakteríu. SDS (natríumdódecýlsúlfat) er algengt þvottaefni, en einnig er hægt að nota valkosti eins og Triton X-100 eða NP-40.

Lysósím: Lýsósím er ensím sem klýfur sérstaklega beta-1,4-glýkósíðtengingar sem eru til staðar í peptíðóglýkanlagi bakteríufrumuveggja. Lýsósímuppbót í lýsisbuffi eykur truflun frumna með því að brjóta niður peptidoglycan netið.

RNase (ríbonukleasi): Ef RNA útdráttur er markmiðið, er hægt að bæta RNase við leysistuðpúðann til að koma í veg fyrir niðurbrot RNA meðan á lýsisferlinu stendur. RNase ensím brjóta niður RNA sameindir með því að kljúfa fosfódíestertengin.

Próteasi (próteinasi K): Ef próteinútdráttur er markmiðið er hægt að fella próteasa eins og próteinasa K inn í leysistuðpinn. Próteinasi K er öflugt ensím sem getur melt mikið úrval próteina án þess að hafa áhrif á uppbyggingu eða virkni markpróteina sem vekur áhuga.

Undirbúningurinn felur í sér að leysa upp viðeigandi magn af Tris-HCl, EDTA, NaCl og valnu þvottaefni í ofurhreinu eða dauðhreinsuðu eimuðu vatni. pH er síðan stillt með óblandaðri saltsýru (HCl) eða natríumhýdroxíði (NaOH) í æskilegt gildi, venjulega um pH 8,0. Lysozyme, RNase og Proteinase K er bætt við í ráðlögðum styrk og lausninni blandað vandlega saman til að tryggja algjöra upplausn allra innihaldsefna.

Endanleg lýsisjafna skal geyma við viðeigandi aðstæður, venjulega -20°C eða -80°C, til að viðhalda stöðugleika hans og koma í veg fyrir niðurbrot ensíma. Fyrir notkun skal þíða biðminni og blanda vandlega til að tryggja einsleitni.

Það er mikilvægt að hámarka samsetningu lýsispúðans út frá tilteknu bakteríunni sem verið er að lýsa og niðurstreymisnotkuninni. Aðlögun á pH, þvottaefnisstyrk eða ensímtegundum getur verið nauðsynleg til að ná skilvirkri frumugreiningu og varðveita heilleika marksameinda.