Koks yra lizės buferio receptas?

Lizės buferis yra tirpalas, naudojamas bakterijų ląstelėms sulaužyti arba „lizuoti“, išlaisvinant tarpląstelinį turinį. Jis plačiai naudojamas molekulinės biologijos ir mikrobiologijos procedūrose, tokiose kaip DNR ir baltymų ekstrakcija. Tiksli lizės buferio sudėtis gali skirtis priklausomai nuo konkretaus naudojimo ir lizuojamų bakterijų tipo, tačiau tipiškas receptas apima šiuos komponentus:

Tris-HCl (tris(hidroksimetil)aminometano hidrochloridas): Tai veikia kaip buferinė medžiaga, palaikanti buferio pH. Lizės buferio pH yra labai svarbus, nes jis gali turėti įtakos fermentų, dalyvaujančių procesuose, stabilumui ir aktyvumui.

EDTA (etilendiaminotetraacto rūgštis): EDTA yra kompleksonas, kuris jungiasi su dvivalenčiais katijonais, tokiais kaip magnis (Mg2+) ir kalcis (Ca2+), kurie yra būtini bakterijų ląstelės sienelės vientisumui palaikyti. Sudarydamas chelatinius šiuos jonus, EDTA susilpnina ląstelės sienelę ir palengvina ląstelių lizę.

NaCl (natrio chloridas): NaCl yra įtrauktas į buferį, siekiant išlaikyti osmosinę pusiausvyrą ir išsaugoti bakterijų ląstelių struktūrinį vientisumą. Tinkama NaCl koncentracija priklauso nuo konkrečių lizuojamų bakterijų tolerancijos druskai.

Ploviklis (pvz., SDS arba Triton X-100): Plovikliai yra esminiai lizės buferio komponentai, nes jie ardo bakterijų ląstelių membranos lipidų dvisluoksnį sluoksnį. SDS (natrio dodecilo sulfatas) yra dažniausiai naudojamas ploviklis, tačiau taip pat galima naudoti tokias alternatyvas kaip Triton X-100 arba NP-40.

lizocimas: Lizocimas yra fermentas, kuris specifiškai skaido beta-1,4-glikozidinius ryšius, esančius bakterijų ląstelių sienelių peptidoglikano sluoksnyje. Lizocimo papildymas lizės buferyje sustiprina ląstelių ardymą, suardydamas peptidoglikano tinklą.

RNazė (ribonukleazė): Jei siekiama išskirti RNR, į lizės buferį galima pridėti RNazės, kad lizės procedūros metu RNR nesuirtų. RNazės fermentai skaido RNR molekules, skaidydami fosfodiesterio ryšius.

Proteazė (proteinazė K): Jei tikslas yra baltymų ekstrahavimas, į lizės buferį gali būti įtraukta tokia proteazė kaip Proteinazė K. Proteinazė K yra tvirtas fermentas, galintis virškinti daugybę baltymų, nepaveikdamas dominančių tikslinių baltymų struktūros ar aktyvumo.

Paruošimas apima atitinkamo Tris-HCl, EDTA, NaCl ir pasirinkto ploviklio kiekio ištirpinimą itin gryname arba steriliame distiliuotame vandenyje. Tada pH sureguliuojamas naudojant koncentruotą druskos rūgštį (HCl) arba natrio hidroksidą (NaOH) iki norimos vertės, paprastai maždaug pH 8,0. Lizocimas, RNazė ir proteinazė K pridedama rekomenduojamomis koncentracijomis, o tirpalas kruopščiai sumaišomas, kad visi komponentai visiškai ištirptų.

Galutinis lizės buferis turi būti laikomas tinkamomis sąlygomis, paprastai -20 °C arba -80 °C, kad būtų išlaikytas jo stabilumas ir išvengta fermentų skilimo. Prieš naudojimą buferį reikia atšildyti ir gerai išmaišyti, kad būtų užtikrintas homogeniškumas.

Svarbu optimizuoti lizės buferio sudėtį, atsižvelgiant į konkrečias lizuojamas bakterijas ir paskesnius pritaikymus. Norint pasiekti veiksmingą ląstelių lizę ir išsaugoti tikslinių molekulių vientisumą, gali prireikti pakoreguoti pH, ploviklio koncentraciją arba fermentų tipus.