Kaip elisa gali būti naudojama identifikuojant bt kukurūzus?

ELISA (su fermentais susieto imunosorbento tyrimo) metodas gali būti naudojamas Bt kukurūzams (genetiškai modifikuotiems kukurūzams, ekspresuojantiems Bacillus thuringiensis insekticidinį baltymą) identifikuoti, nustatant Bt baltymo buvimą kukurūzų mėginiuose. Štai kaip tai veikia:

1. Mėginio paruošimas:Kukurūzų mėginiai surenkami ir sumalami į smulkius miltelius. Tada mėginys ekstrahuojamas buferiniu tirpalu, kad išsiskirtų baltymai, įskaitant Bt baltymą.

2. Mikroplokštelės šulinėlių padengimas:Mikroplokštelės šulinėliai yra padengti Bt baltymui būdingu fiksuojančiu antikūnu. Šis antikūnas yra imobilizuotas šulinėlių paviršiuje.

3. Inkubavimas su mėginio ekstraktu:Kukurūzų mėginio ekstraktas įpilamas į mikroplokštelės šulinėlius ir inkubuojamas tam tikrą laikotarpį, leidžiant Bt baltymui prisijungti prie fiksuojančio antikūno.

4. Plovimo etapai:Po inkubacijos šulinėliai išplaunami buferiniu tirpalu, kad būtų pašalintos nesusijungusios medžiagos.

5. Aptikimo antikūno pridėjimas:į duobutes pridedamas aptikimo antikūnas, kuris yra konjuguotas su fermentu (dažniausiai krienų peroksidaze). Šis aptikimo antikūnas yra specifinis kitam Bt baltymo epitopui nei gaudantis antikūnas.

6. Antrasis inkubavimas:mikroplokštelė vėl inkubuojama, leidžiant aptikimo antikūnui prisijungti prie Bt baltymo, užfiksuoto fiksuojančio antikūno.

7. Substrato pridėjimas:į duobutes įpilamas substrato tirpalas, būdingas fermentui, konjuguotam su aptikimo antikūnu. Esant fermentui, substrate vyksta reakcija, kurios metu susidaro spalvotas arba fluorescencinis produktas.

8. Kolorimetrinis arba fluorometrinis aptikimas:kiekvieno šulinėlio absorbcija (kolorimetriniam aptikimui) arba fluorescencija (fluorometriniam aptikimui) matuojama naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

9. Duomenų analizė. Gautos absorbcijos arba fluorescencijos vertės palyginamos su standartine kreive, sudaryta naudojant žinomas Bt baltymo koncentracijas. Tai leidžia kiekybiškai įvertinti Bt baltymą, esantį kukurūzų mėginyje.

Nustačius Bt baltymo buvimą ir kiekį, ELISA gali būti naudojamas Bt kukurūzams identifikuoti ir atskirti nuo ne Bt kukurūzų mėginių. Teigiami rezultatai rodo, kad yra Bt baltymo, o neigiami rezultatai rodo, kad Bt baltymo nėra arba lygis yra mažesnis už tyrimo aptikimo ribą.