Wat is het recept voor Lysisbuffer?

Lysisbuffer is een oplossing die wordt gebruikt om bacteriële cellen open te breken of te 'lyseren', waardoor de intracellulaire inhoud vrijkomt. Het wordt veel gebruikt in procedures in de moleculaire biologie en microbiologie, zoals DNA- en eiwitextractie. De exacte samenstelling van de lysisbuffer kan variëren afhankelijk van de specifieke toepassing en het type bacterie dat wordt gelyseerd, maar een typisch recept bevat de volgende componenten:

Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride): Dit fungeert als buffermiddel om de pH van de buffer op peil te houden. De pH van de lysisbuffer is cruciaal omdat deze de stabiliteit en activiteit van enzymen die bij de stappen betrokken zijn, kan beïnvloeden.

EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur): EDTA is een chelaatvormer die zich bindt aan tweewaardige kationen zoals magnesium (Mg2+) en calcium (Ca2+), die essentieel zijn voor het behoud van de integriteit van de bacteriële celwand. Door deze ionen te cheleren verzwakt EDTA de celwand en vergemakkelijkt het de cellyse.

NaCl (natriumchloride): NaCl wordt in de buffer opgenomen om het osmotische evenwicht te behouden en de structurele integriteit van de bacteriecellen te behouden. De juiste NaCl-concentratie hangt af van de zouttolerantie van de specifieke bacteriën die worden gelyseerd.

Wasmiddel (bijvoorbeeld SDS of Triton X-100): Detergentia zijn cruciale componenten van de lysisbuffer omdat ze de lipidedubbellaag van het bacteriële celmembraan verstoren. SDS (natriumdodecylsulfaat) is een veelgebruikt wasmiddel, maar ook alternatieven als Triton X-100 of NP-40 kunnen worden gebruikt.

Lysozym: Lysozym is een enzym dat specifiek de bèta-1,4-glycosidische bindingen splitst die aanwezig zijn in de peptidoglycaanlaag van bacteriële celwanden. Lysozym-suppletie in lysisbuffer verbetert de celverstoring door het peptidoglycaannetwerk af te breken.

RNase (ribonuclease): Als RNA-extractie het doel is, kan RNase aan de lysebuffer worden toegevoegd om afbraak van RNA tijdens de lyseprocedure te voorkomen. RNase-enzymen breken RNA-moleculen af ​​door de fosfodiësterbindingen te splitsen.

Protease (Proteïnase K): Als eiwitextractie het doel is, kan een protease zoals Proteinase K in de lysisbuffer worden opgenomen. Proteïnase K is een robuust enzym dat een breed scala aan eiwitten kan verteren zonder de structuur of activiteit van de beoogde doeleiwitten te beïnvloeden.

De bereiding omvat het oplossen van de juiste hoeveelheden Tris-HCl, EDTA, NaCl en het geselecteerde detergens in ultrapuur of steriel gedestilleerd water. De pH wordt vervolgens aangepast met geconcentreerd zoutzuur (HCl) of natriumhydroxide (NaOH) tot de gewenste waarde, doorgaans rond pH 8,0. Lysozym, RNase en Proteinase K worden in de aanbevolen concentraties toegevoegd en de oplossing wordt grondig gemengd om volledige oplossing van alle componenten te garanderen.

De uiteindelijke lysisbuffer moet bij geschikte omstandigheden worden bewaard, gewoonlijk -20°C of -80°C, om de stabiliteit ervan te behouden en afbraak van enzymen te voorkomen. Vóór gebruik moet de buffer worden ontdooid en grondig worden gemengd om homogeniteit te garanderen.

Het is belangrijk om de samenstelling van de lysisbuffer te optimaliseren op basis van de specifieke bacteriën die worden gelyseerd en de downstream-toepassingen. Aanpassingen aan de pH, concentratie van detergens of enzymtypes kunnen nodig zijn om efficiënte cellyse te bereiken en de integriteit van doelmoleculen te behouden.