Hva er oppskriften på Lysis buffer?

Lysebuffer er en løsning som brukes til å bryte opp eller 'lysere' bakterieceller, og frigjøre det intracellulære innholdet. Det er mye brukt i molekylærbiologi og mikrobiologiske prosedyrer, for eksempel DNA- og proteinekstraksjon. Den nøyaktige sammensetningen av lyseringsbuffer kan variere avhengig av den spesifikke applikasjonen og typen bakterier som lyseres, men en typisk oppskrift inkluderer følgende komponenter:

Tris-HCl (Tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid): Dette fungerer som et buffermiddel for å opprettholde pH i bufferen. Lyseringsbufferens pH er avgjørende siden den kan påvirke stabiliteten og aktiviteten til enzymer som er involvert i trinn.

EDTA (etylendiamintetraeddiksyre): EDTA er et chelateringsmiddel som binder seg til toverdige kationer som magnesium (Mg2+) og kalsium (Ca2+), som er avgjørende for å opprettholde integriteten til bakteriecelleveggen. Ved å chelatere disse ionene, svekker EDTA celleveggen og letter cellelyse.

NaCl (natriumklorid): NaCl er inkludert i bufferen for å opprettholde osmotisk balanse og bevare den strukturelle integriteten til bakteriecellene. Den passende NaCl-konsentrasjonen avhenger av salttoleransen til de spesifikke bakteriene som lyseres.

Vaskemiddel (f.eks. SDS eller Triton X-100): Vaskemidler er avgjørende komponenter i lyseringsbufferen da de forstyrrer lipid-dobbeltlaget i bakteriecellemembranen. SDS (sodium dodecyl sulfate) er et vanlig vaskemiddel, men alternativer som Triton X-100 eller NP-40 kan også brukes.

Lysozym: Lysozym er et enzym som spesifikt spalter beta-1,4-glykosidbindingene som er tilstede i peptidoglykanlaget av bakteriecellevegger. Lysozymtilskudd i lyseringsbuffer forbedrer celleforstyrrelser ved å bryte ned peptidoglykannettverket.

RNase (ribonuklease): Hvis RNA-ekstraksjon er målet, kan RNase tilsettes til lyseringsbufferen for å forhindre nedbrytning av RNA under lyseringsprosedyren. RNase-enzymer bryter ned RNA-molekyler ved å spalte fosfodiesterbindingene.

Protease (Proteinase K): Hvis proteinekstraksjon er målet, kan en protease som Proteinase K inkorporeres i lyseringsbufferen. Proteinase K er et robust enzym som kan fordøye et bredt spekter av proteiner uten å påvirke strukturen eller aktiviteten til målproteiner av interesse.

Preparatet innebærer å løse opp passende mengder Tris-HCl, EDTA, NaCl og det valgte vaskemiddelet i ultrarent eller sterilt destillert vann. pH justeres deretter med konsentrert saltsyre (HCl) eller natriumhydroksid (NaOH) til ønsket verdi, typisk rundt pH 8,0. Lysozym, RNase og Proteinase K tilsettes i anbefalte konsentrasjoner, og løsningen blandes grundig for å sikre fullstendig oppløsning av alle komponenter.

Den endelige lyseringsbufferen bør oppbevares ved passende forhold, vanligvis -20°C eller -80°C, for å opprettholde stabiliteten og forhindre nedbrytning av enzymer. Før bruk bør bufferen tines og blandes grundig for å sikre homogenitet.

Det er viktig å optimalisere sammensetningen av lyseringsbufferen basert på de spesifikke bakteriene som lyseres og nedstrømsapplikasjonene. Justering av pH, vaskemiddelkonsentrasjon eller enzymtyper kan være nødvendig for å oppnå effektiv cellelyse og bevare integriteten til målmolekylene.