Каков рецепт буфера для лизиса?

Буфер для лизиса представляет собой раствор, используемый для вскрытия или «лизирования» бактериальных клеток с высвобождением внутриклеточного содержимого. Он широко используется в молекулярной биологии и микробиологических процедурах, таких как экстракция ДНК и белков. Точный состав лизирующего буфера может варьироваться в зависимости от конкретного применения и типа лизируемых бактерий, но типичный рецепт включает следующие компоненты:

Трис-HCl (трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид): Он действует как буферный агент для поддержания pH буфера. Значение pH буфера для лизиса имеет решающее значение, поскольку оно может влиять на стабильность и активность ферментов, участвующих в стадиях лизиса.

ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота): ЭДТА представляет собой хелатирующий агент, который связывается с двухвалентными катионами, такими как магний (Mg2+) и кальций (Ca2+), которые необходимы для поддержания целостности бактериальной клеточной стенки. Хелатируя эти ионы, ЭДТА ослабляет клеточную стенку и облегчает лизис клеток.

NaCl (хлорид натрия): NaCl включен в буфер для поддержания осмотического баланса и сохранения структурной целостности бактериальных клеток. Соответствующая концентрация NaCl зависит от солеустойчивости конкретных лизируемых бактерий.

Моющее средство (например, SDS или Triton X-100): Детергенты являются важнейшими компонентами лизирующего буфера, поскольку они разрушают липидный бислой мембраны бактериальных клеток. SDS (додецилсульфат натрия) является широко используемым моющим средством, но также можно использовать его альтернативы, такие как Triton X-100 или NP-40.

Лизоцим: Лизоцим представляет собой фермент, который специфически расщепляет бета-1,4-гликозидные связи, присутствующие в пептидогликановом слое клеточных стенок бактерий. Добавление лизоцима в лизирующий буфер усиливает разрушение клеток за счет разрушения сети пептидогликана.

РНКаза (рибонуклеаза): Если целью является экстракция РНК, в буфер для лизиса можно добавить РНКазу, чтобы предотвратить деградацию РНК во время процедуры лизиса. Ферменты РНКазы разрушают молекулы РНК, расщепляя фосфодиэфирные связи.

Протеаза (протеиназа К): Если целью является экстракция белка, в буфер для лизиса можно включить протеазу, такую ​​как протеиназа К. Протеиназа К — это мощный фермент, который может переваривать широкий спектр белков, не влияя на структуру или активность интересующих белков-мишеней.

Приготовление включает растворение соответствующих количеств Трис-HCl, ЭДТА, NaCl и выбранного моющего средства в сверхчистой или стерильной дистиллированной воде. Затем pH доводят до желаемого значения, используя концентрированную соляную кислоту (HCl) или гидроксид натрия (NaOH), обычно около pH 8,0. Добавляют лизоцим, РНКазу и протеиназу К в рекомендуемых концентрациях и тщательно перемешивают раствор, чтобы обеспечить полное растворение всех компонентов.

Конечный буфер для лизиса следует хранить при соответствующих условиях, обычно -20°C или -80°C, чтобы сохранить его стабильность и предотвратить деградацию ферментов. Перед применением буфер следует разморозить и тщательно перемешать для обеспечения однородности.

Важно оптимизировать состав буфера для лизиса с учетом конкретных лизируемых бактерий и последующих применений. Для достижения эффективного лизиса клеток и сохранения целостности целевых молекул может потребоваться корректировка pH, концентрации детергента или типов ферментов.