Aký je recept na Lysis buffer?

Lýzový pufor je roztok používaný na rozbitie alebo „lýzu“ bakteriálnych buniek, čím sa uvoľní vnútrobunkový obsah. Je široko používaný v molekulárnej biológii a mikrobiologických postupoch, ako je extrakcia DNA a proteínov. Presné zloženie lyzačného pufra sa môže líšiť v závislosti od špecifickej aplikácie a typu lýzovanej baktérie, ale typický recept obsahuje nasledujúce zložky:

Tris-HCl (Tris(hydroxymetyl)aminometán hydrochlorid): Toto pôsobí ako pufrovacie činidlo na udržanie pH pufra. pH lyzačného pufra je rozhodujúce, pretože môže ovplyvniť stabilitu a aktivitu enzýmov zapojených do krokov.

EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová): EDTA je chelatačné činidlo, ktoré sa viaže na dvojmocné katióny ako horčík (Mg2+) a vápnik (Ca2+), ktoré sú nevyhnutné na udržanie integrity bakteriálnej bunkovej steny. Chelatovaním týchto iónov EDTA oslabuje bunkovú stenu a uľahčuje bunkovú lýzu.

NaCl (chlorid sodný): NaCl je súčasťou pufra na udržanie osmotickej rovnováhy a zachovanie štrukturálnej integrity bakteriálnych buniek. Vhodná koncentrácia NaCl závisí od tolerancie solí špecifických lyzovaných baktérií.

Detergent (napr. SDS alebo Triton X-100): Detergenty sú rozhodujúcimi zložkami lyzačného pufra, pretože narúšajú lipidovú dvojvrstvu bakteriálnej bunkovej membrány. SDS (dodecylsulfát sodný) je bežne používaný detergent, ale možno použiť aj alternatívy ako Triton X-100 alebo NP-40.

Lysozým: Lysozým je enzým, ktorý špecificky štiepi beta-1,4-glykozidové väzby prítomné v peptidoglykánovej vrstve bakteriálnych bunkových stien. Suplementácia lyzozýmom v lyzovacom pufri zvyšuje rozrušenie buniek rozkladom peptidoglykánovej siete.

RNáza (ribonukleáza): Ak je cieľom extrakcia RNA, do lyzačného tlmivého roztoku možno pridať RNázu, aby sa zabránilo degradácii RNA počas procesu lýzy. Enzýmy RNázy degradujú molekuly RNA štiepením fosfodiesterových väzieb.

Proteáza (Proteináza K): Ak je cieľom extrakcia proteínu, do lyzačného pufra sa môže začleniť proteáza, ako je proteináza K. Proteináza K je robustný enzým, ktorý dokáže tráviť široké spektrum proteínov bez ovplyvnenia štruktúry alebo aktivity cieľových proteínov, ktoré sú predmetom záujmu.

Príprava zahŕňa rozpustenie príslušných množstiev Tris-HCl, EDTA, NaCl a vybraného detergentu v ultračistej alebo sterilnej destilovanej vode. pH sa potom upraví pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (HCl) alebo hydroxidu sodného (NaOH) na požadovanú hodnotu, typicky okolo pH 8,0. Lysozým, RNáza a proteináza K sa pridajú v odporúčaných koncentráciách a roztok sa dôkladne premieša, aby sa zabezpečilo úplné rozpustenie všetkých zložiek.

Konečný lyzačný pufor by sa mal skladovať za vhodných podmienok, zvyčajne -20 °C alebo -80 °C, aby sa zachovala jeho stabilita a zabránilo sa degradácii enzýmov. Pred použitím je potrebné pufor rozmraziť a dôkladne premiešať, aby sa zabezpečila homogenita.

Je dôležité optimalizovať zloženie lyzačného pufra na základe špecifických lyzovaných baktérií a následných aplikácií. Na dosiahnutie účinnej bunkovej lýzy a zachovanie integrity cieľových molekúl môžu byť potrebné úpravy pH, koncentrácie detergentu alebo typov enzýmov.