Vad är receptet för Lysis buffert?

Lysbuffert är en lösning som används för att bryta upp eller "lysera" bakterieceller och frigöra det intracellulära innehållet. Det används ofta i molekylärbiologi och mikrobiologiska procedurer, såsom DNA- och proteinextraktion. Den exakta sammansättningen av lyseringsbuffert kan variera beroende på den specifika applikationen och typen av bakterier som lyseras, men ett typiskt recept innehåller följande komponenter:

Tris-HCl (Tris(hydroximetyl)aminometanhydroklorid): Detta fungerar som ett buffertmedel för att upprätthålla buffertens pH. Lysbuffertens pH är avgörande eftersom det kan påverka stabiliteten och aktiviteten hos enzymer som är involverade i steg.

EDTA (etylendiamintetraättiksyra): EDTA är ett kelatbildande medel som binder till tvåvärda katjoner som magnesium (Mg2+) och kalcium (Ca2+), vilka är viktiga för att bibehålla integriteten hos bakteriecellväggen. Genom att kelatisera dessa joner försvagar EDTA cellväggen och underlättar cellys.

NaCl (natriumklorid): NaCl ingår i bufferten för att upprätthålla osmotisk balans och bevara bakteriecellernas strukturella integritet. Den lämpliga NaCl-koncentrationen beror på salttoleransen hos de specifika bakterier som lyseras.

Tvättmedel (t.ex. SDS eller Triton X-100): Detergenter är avgörande komponenter i lysbufferten eftersom de stör lipiddubbelskiktet i bakteriecellmembranet. SDS (natriumdodecylsulfat) är ett vanligt tvättmedel, men alternativ som Triton X-100 eller NP-40 kan också användas.

Lysozym: Lysozym är ett enzym som specifikt klyver de beta-1,4-glykosidbindningar som finns i peptidoglykanskiktet av bakteriecellsväggar. Lysozymtillskott i lyseringsbuffert förstärker cellavbrott genom att bryta ner peptidoglykannätverket.

RNas (ribonukleas): Om RNA-extraktion är målet, kan RNas tillsättas till lysbufferten för att förhindra nedbrytning av RNA under lyseringsproceduren. RNas-enzymer bryter ner RNA-molekyler genom att klyva fosfodiesterbindningarna.

Proteas (Proteinas K): Om proteinextraktion är målet kan ett proteas som Proteinas K införlivas i lysbufferten. Proteinas K är ett robust enzym som kan smälta ett brett spektrum av proteiner utan att påverka strukturen eller aktiviteten hos målproteiner av intresse.

Beredningen involverar upplösning av lämpliga mängder Tris-HCl, EDTA, NaCl och det valda tvättmedlet i ultrarent eller sterilt destillerat vatten. pH justeras sedan med koncentrerad saltsyra (HCl) eller natriumhydroxid (NaOH) till önskat värde, typiskt runt pH 8,0. Lysozym, RNase och Proteinas K tillsätts i de rekommenderade koncentrationerna och lösningen blandas noggrant för att säkerställa fullständig upplösning av alla komponenter.

Den slutliga lyseringsbufferten bör förvaras vid lämpliga förhållanden, vanligtvis -20°C eller -80°C, för att bibehålla dess stabilitet och förhindra nedbrytning av enzymer. Före användning ska bufferten tinas och blandas noggrant för att säkerställa homogenitet.

Det är viktigt att optimera sammansättningen av lyseringsbufferten baserat på de specifika bakterier som lyseras och nedströmsapplikationerna. Justeringar av pH, tvättmedelskoncentration eller enzymtyper kan vara nödvändiga för att uppnå effektiv cellys och bevara integriteten hos målmolekyler.