Каква е рецептата за лизисния буфер?

Буфер за лизис е разтвор, използван за отваряне или „лизиране“ на бактериални клетки, освобождавайки вътреклетъчното съдържание. Той се използва широко в процедури на молекулярна биология и микробиология, като ДНК и протеинова екстракция. Точният състав на лизиращия буфер може да варира в зависимост от конкретното приложение и вида на бактериите, които се лизират, но типичната рецепта включва следните компоненти:

Трис-HCl (Трис(хидроксиметил)аминометан хидрохлорид): Това действа като буфериращ агент за поддържане на pH на буфера. pH на лизиращия буфер е от решаващо значение, тъй като може да повлияе на стабилността и активността на ензимите, участващи в стъпките на 后续.

EDTA (етилендиаминтетраоцетна киселина): EDTA е хелатиращ агент, който се свързва с двувалентни катиони като магнезий (Mg2+) и калций (Ca2+), които са от съществено значение за поддържане целостта на бактериалната клетъчна стена. Чрез хелатиране на тези йони, EDTA отслабва клетъчната стена и улеснява клетъчния лизис.

NaCl (натриев хлорид): NaCl е включен в буфера за поддържане на осмотичния баланс и запазване на структурната цялост на бактериалните клетки. Подходящата концентрация на NaCl зависи от солната толерантност на специфичните бактерии, които се лизират.

Детергент (напр. SDS или Triton X-100): Детергентите са решаващи компоненти на лизиращия буфер, тъй като те разрушават липидния двоен слой на бактериалната клетъчна мембрана. SDS (натриев додецил сулфат) е често използван детергент, но могат да се използват и алтернативи като Triton X-100 или NP-40.

Лизозим: Лизозимът е ензим, който специфично разцепва бета-1,4-гликозидните връзки, присъстващи в пептидогликановия слой на бактериалните клетъчни стени. Добавянето на лизозим в лизисен буфер засилва разрушаването на клетките чрез разрушаване на пептидогликановата мрежа.

РНКаза (рибонуклеаза): Ако целта е екстракцията на РНК, РНКаза може да се добави към лизисния буфер, за да се предотврати разграждането на РНК по време на процедурата на лизис. РНКазните ензими разграждат РНК молекулите чрез разцепване на фосфодиестерните връзки.

Протеаза (протеиназа К): Ако целта е екстракция на протеин, протеаза като протеиназа К може да бъде включена в лизиращия буфер. Протеиназа К е силен ензим, който може да смила широка гама от протеини, без да засяга структурата или активността на целевите протеини, които представляват интерес.

Приготвянето включва разтваряне на подходящи количества Tris-HCl, EDTA, NaCl и избрания детергент в ултрачиста или стерилна дестилирана вода. След това pH се регулира с помощта на концентрирана солна киселина (HCl) или натриев хидроксид (NaOH) до желаната стойност, обикновено около pH 8,0. Добавят се лизозим, РНКаза и протеиназа К в препоръчаните концентрации и разтворът се разбърква старателно, за да се осигури пълно разтваряне на всички компоненти.

Крайният лизисен буфер трябва да се съхранява при подходящи условия, обикновено -20°C или -80°C, за да се поддържа неговата стабилност и да се предотврати разграждането на ензимите. Преди употреба буферът трябва да се размрази и разбърка добре, за да се осигури хомогенност.

Важно е да се оптимизира съставът на лизиращия буфер въз основа на специфичните бактерии, които се лизират, и приложенията надолу по веригата. Може да са необходими корекции на pH, концентрацията на детергента или видовете ензими, за да се постигне ефективен клетъчен лизис и да се запази целостта на целевите молекули.