Mikä on Lysis-puskurin resepti?

Lyysipuskuri on liuos, jota käytetään bakteerisolujen avaamiseen tai "lysoimiseen" vapauttaen solunsisäistä sisältöä. Sitä käytetään laajasti molekyylibiologian ja mikrobiologian menetelmissä, kuten DNA:n ja proteiinien uuttamisessa. Hajotuspuskurin tarkka koostumus voi vaihdella riippuen käyttökohteesta ja lyysattavien bakteerien tyypistä, mutta tyypillinen resepti sisältää seuraavat komponentit:

Tris-HCl (Tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridi): Tämä toimii puskuroivana aineena puskurin pH:n ylläpitämiseksi. Hajotuspuskurin pH on ratkaisevan tärkeä, koska se voi vaikuttaa vaiheisiin osallistuvien entsyymien stabiilisuuteen ja aktiivisuuteen.

EDTA (etyleenidiamiinitetraetikkahappo): EDTA on kelatoiva aine, joka sitoutuu kaksiarvoisiin kationeihin, kuten magnesiumin (Mg2+) ja kalsiumiin (Ca2+), jotka ovat välttämättömiä bakteerisolun seinämän eheyden ylläpitämiselle. Kelatoimalla näitä ioneja EDTA heikentää soluseinää ja helpottaa solujen hajoamista.

NaCl (natriumkloridi): NaCl sisältyy puskuriin osmoottisen tasapainon ylläpitämiseksi ja bakteerisolujen rakenteellisen eheyden säilyttämiseksi. Sopiva NaCl-pitoisuus riippuu tiettyjen lyysattavien bakteerien suolatoleranssista.

Pesuaine (esim. SDS tai Triton X-100): Pesuaineet ovat lyysipuskurin tärkeitä komponentteja, koska ne hajottavat bakteerisolukalvon lipidikaksoiskerroksen. SDS (natriumdodekyylisulfaatti) on yleisesti käytetty pesuaine, mutta vaihtoehtoja, kuten Triton X-100 tai NP-40, voidaan myös käyttää.

Lysotsyymi: Lysotsyymi on entsyymi, joka spesifisesti pilkkoo bakteerisolujen seinämien peptidoglykaanikerroksessa olevat beeta-1,4-glykosidisidokset. Lysotsyymin lisäys lyysipuskurissa tehostaa solujen hajoamista hajottamalla peptidoglykaaniverkoston.

RNaasi (ribonukleaasi): Jos tavoitteena on RNA:n uuttaminen, RNaasia voidaan lisätä lyysipuskuriin RNA:n hajoamisen estämiseksi lyysitoimenpiteen aikana. RNaasientsyymit hajottavat RNA-molekyylejä katkaisemalla fosfodiesterisidoksia.

Proteaasi (proteinaasi K): Jos proteiinin uuttaminen on tavoitteena, proteaasi, kuten Proteinase K, voidaan sisällyttää lyysipuskuriin. Proteinaasi K on vahva entsyymi, joka pystyy pilkkomaan monenlaisia ​​proteiineja vaikuttamatta kiinnostuksen kohteena olevien kohdeproteiinien rakenteeseen tai aktiivisuuteen.

Valmistuksessa liuotetaan sopivat määrät Tris-HCl:a, EDTA:ta, NaCl:a ja valittua pesuainetta ultrapuhtaan tai steriiliin tislattuun veteen. Sen jälkeen pH säädetään väkevällä kloorivetyhapolla (HCl) tai natriumhydroksidilla (NaOH) haluttuun arvoon, tyypillisesti noin pH 8,0:aan. Lysotsyymi, RNaasi ja proteinaasi K lisätään suositelluissa pitoisuuksissa, ja liuos sekoitetaan huolellisesti kaikkien komponenttien täydellisen liukenemisen varmistamiseksi.

Lopullinen lyysipuskuri tulee säilyttää sopivissa olosuhteissa, tavallisesti -20 °C tai -80 °C, jotta se säilyy stabiilina ja estetään entsyymien hajoaminen. Ennen käyttöä puskuri on sulatettava ja sekoitettava huolellisesti homogeenisuuden varmistamiseksi.

On tärkeää optimoida lyysipuskurin koostumus tiettyjen lyysattavien bakteerien ja myöhempien sovellusten perusteella. pH:n, pesuainepitoisuuden tai entsyymityyppien säätäminen saattaa olla tarpeen tehokkaan solulyysin saavuttamiseksi ja kohdemolekyylien eheyden säilyttämiseksi.