Kakšen je recept za lizni pufer?

Lizni pufer je raztopina, ki se uporablja za razbijanje ali „lizo“ bakterijskih celic, pri čemer se sprosti znotrajcelična vsebina. Široko se uporablja v postopkih molekularne biologije in mikrobiologije, kot sta ekstrakcija DNK in beljakovin. Natančna sestava pufra za lizo se lahko razlikuje glede na posebno uporabo in vrsto bakterije, ki se lizira, vendar tipičen recept vključuje naslednje komponente:

Tris-HCl (tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorid): To deluje kot pufrsko sredstvo za vzdrževanje pH pufra. pH liznega pufra je ključnega pomena, saj lahko vpliva na stabilnost in aktivnost encimov, vključenih v korake 后续.

EDTA (etilendiamintetraocetna kislina): EDTA je kelatno sredstvo, ki se veže na dvovalentne katione, kot sta magnezij (Mg2+) in kalcij (Ca2+), ki sta bistvena za ohranjanje celovitosti bakterijske celične stene. S keliranjem teh ionov EDTA oslabi celično steno in olajša celično lizo.

NaCl (natrijev klorid): NaCl je vključen v pufr za vzdrževanje osmotskega ravnovesja in ohranjanje strukturne celovitosti bakterijskih celic. Ustrezna koncentracija NaCl je odvisna od tolerance soli specifične bakterije, ki jo liziramo.

Detergent (npr. SDS ali Triton X-100): Detergenti so ključne sestavine liznega pufra, saj porušijo lipidni dvosloj celične membrane bakterij. SDS (natrijev dodecil sulfat) je pogosto uporabljen detergent, vendar se lahko uporabijo tudi alternative, kot sta Triton X-100 ali NP-40.

Lizocim: Lizocim je encim, ki specifično cepi beta-1,4-glikozidne vezi, prisotne v peptidoglikanski plasti bakterijskih celičnih sten. Dodatek lizocima v liznem pufru poveča motnje celic z razgradnjo peptidoglikanske mreže.

RNAza (ribonukleaza): Če je cilj ekstrakcija RNK, lahko liznemu pufru dodamo RNKazo, da preprečimo razgradnjo RNK med postopkom lize. Encimi RNaze razgradijo molekule RNK s cepitvijo fosfodiestrskih vezi.

Proteaza (proteinaza K): Če je cilj ekstrakcija proteina, lahko proteazo, kot je proteinaza K, vključimo v lizni pufer. Proteinaza K je robusten encim, ki lahko prebavi široko paleto beljakovin, ne da bi vplival na strukturo ali aktivnost ciljnih beljakovin, ki nas zanimajo.

Priprava vključuje raztapljanje ustreznih količin Tris-HCl, EDTA, NaCl in izbranega detergenta v ultra čisti ali sterilni destilirani vodi. pH se nato prilagodi s koncentrirano klorovodikovo kislino (HCl) ali natrijevim hidroksidom (NaOH) na želeno vrednost, običajno okoli pH 8,0. Dodamo lizocim, RNazo in proteinazo K v priporočenih koncentracijah in raztopino temeljito premešamo, da zagotovimo popolno raztapljanje vseh komponent.

Končni lizni pufer je treba hraniti pri ustreznih pogojih, običajno -20 °C ali -80 °C, da se ohrani njegova stabilnost in prepreči razgradnja encimov. Pred uporabo je treba pufer odmrzniti in temeljito premešati, da zagotovimo homogenost.

Pomembno je optimizirati sestavo liznega pufra na podlagi specifičnih bakterij, ki se lizirajo, in nadaljnjih aplikacij. Za doseganje učinkovite celične lize in ohranitev celovitosti ciljnih molekul bodo morda potrebne prilagoditve pH, koncentracije detergenta ali vrst encimov.